Mouse  IL-6 ELISA試劑盒原理說(shuō)明

IL-6 簡(jiǎn)介： 白細(xì)胞介素 6（IL-6）是一種多功能蛋白，在宿主防御、急性期反應(yīng)、免疫反應(yīng)和造血中發(fā)揮重要作用。IL-6 由各種正常和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表達(dá)，包括 T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、 星形細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和各種腫瘤細(xì)胞。IL-6 的產(chǎn)生被許多信號(hào)上調(diào)，包括有絲分裂或抗原刺激、LPS、鈣 離子團(tuán)、IL-1、IL-2、IFN、TNF、PDGF 和病毒。IL-6 在單核細(xì)胞中的表達(dá)受到 IL-4 和 IL-13 的抑制。

實(shí)驗(yàn)原理： 本試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被有小鼠白細(xì)胞介素 6（IL-6）捕獲抗體的 微孔中，依次加入樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，HRP 酶結(jié)合物，中間經(jīng)過(guò)溫育和洗滌，用底物 TMB 顯色，TMB 在過(guò)氧化物酶(HRP)的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中 的小鼠白細(xì)胞介素 6（IL-6）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品濃度。

試劑盒參數(shù)： 需自備的設(shè)備及試劑： 1. 450±10nm 濾光片酶標(biāo)儀 2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL. 3. Eppendorf 移液器. 4. 蒸餾水或去離子水. 5. 脫脂棉吸水紙. 6. 37℃恒溫箱. 8. 準(zhǔn)備若干個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋管. 

樣本處理及要求：

1. 試劑盒檢測(cè)范圍不等同于樣本中待測(cè)物的濃度范圍，建議實(shí)驗(yàn)前通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)預(yù)估樣本中待測(cè)物的濃度并 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定樣本的實(shí)際濃度情況。如果樣品中待測(cè)物濃度過(guò)高或過(guò)低，請(qǐng)對(duì)樣本做適當(dāng)?shù)南♂尰驖饪s。 

2. 若所檢樣本不在說(shuō)明書(shū)所列樣本之中，建議做預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其檢測(cè)有效性。 

3. 血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置 2 小時(shí)或 4℃過(guò)夜，然后 1000×g 離心 20 分鐘，取上清 即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

4. 血漿：用 EDTA 或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的 30 分鐘內(nèi)于 2-8℃1000×g 離心 15 分鐘， 取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

5. 組織勻漿：用預(yù)冷的 PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié) 果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的 PBS（一般按 1:9 的重量體積比，比如 1g 的組織樣 品對(duì)應(yīng) 9mL 的 PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在 PBS 中加入蛋白酶抑制劑） 加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍 融。最后將勻漿液于 5000×g 離心 5~10 分鐘，取上清檢測(cè)。 

6. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請(qǐng) 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免 反復(fù)凍融。

7. 其它生物標(biāo)本：1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測(cè)。

8. 樣品外觀：樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。 

9. 樣品保存：樣品收集后若在 1 周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可保存于 4℃，若不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次使用量分裝，凍 存于-20℃（1 個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），或-80℃（6 個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），避免反復(fù)凍融，標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果， 因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。 性能 靈敏度 2.63pg/mL 檢測(cè)范圍 7.81-500pg/mL 特異性 可檢測(cè)樣本中小鼠的 IL-6，且與其類似物無(wú)明顯交叉反應(yīng).

操作步驟： 1. 從室溫平衡 10 分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回 4℃。 

2. 加樣：分別將樣品或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品按照 100μl 每孔加入相應(yīng)孔中，空白孔加入 100μL 通用稀釋液。蓋 上封板膜后 37℃溫育 1 小時(shí)。（建議：將待測(cè)樣本用通用稀釋液稀釋 1 倍后再加入酶標(biāo)板內(nèi)測(cè)試。從 而減少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)試結(jié)果的誤差影響，最后計(jì)算樣本濃度時(shí)需乘以對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)。所有的待測(cè)樣本和 標(biāo)準(zhǔn)品在檢測(cè)中建議設(shè)立復(fù)孔）。

3. 加生物素化抗體：取出酶標(biāo)板，棄去液體，不用洗滌。每孔直接加入生物素化抗體工作液 100μL，蓋上封 板膜后 37℃溫育 1 小時(shí)。

4. 洗板：棄去液體，每孔加入 300μL 1x 洗滌液，靜置 1 分鐘，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板 3 次（也可用洗板機(jī)洗板）。

5. 加酶結(jié)合物工作液：每孔加入酶結(jié)合物工作液 100μL，蓋上封板膜后 37℃溫育 30 分鐘。

6. 洗板：棄去液體按步驟 4 洗滌方法，洗板 5 次。 

7. 加底物：每孔加入底物(TMB)90μL，蓋上封板膜，37℃避光溫育 15 分鐘。 

8. 加終止液：取出酶標(biāo)板，每孔直接加入終止液 50μL，立即在 450nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的 OD 值。

結(jié)果判斷：

1. 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(作圖時(shí)去掉空白組的值)。

2. 若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)并在計(jì)算樣本濃度時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)據(jù)和參考曲線：

以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

試劑盒性能：

1. 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于10%。

2. 回收率：在選取的健康小鼠血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入3個(gè)不同濃度水平的小鼠IL-6，計(jì)算回收率

3. 線性稀釋：分別在選取的4份健康小鼠血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度小鼠IL-6，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋，評(píng)估線性。